ClearSee ®は、固定、洗浄、透明化の3ステップで透明化処理を行うことが可能です。
植物科学研究のツールとして、細胞レベルの現象と個体全体をつなぐシステムの解明などが期待されます。
HPデータ：名古屋大学大学院理学研究科 栗原大輔特任助教・水多陽子さきがけ研究者より提供
リンク関係
ClearSee ®プロトコル
ClearSee ®を用いた透明化方法は1) 固定、2) 洗浄、3) 透明化の3ステップです。
詳しくは製品に添付されてますプロトコルをご確認下さい。下記は、シロイヌナズナの葉、幼植物を例にした場合です。
| 1．固定 ① 4%パラホルムアルデヒド溶液を用いて、サンプルを固定する*1。 |
| ② デシケーターにサンプルを入れ、真空ポンプにより減圧し、室温で30分、静置し、固定する。 この作業を2回繰り返す。 減圧中に植物試料が飛び出るのを防ぐために、マイクロチューブのフタを開け、パラフィンフィルムで密封し、針で通期穴を数カ所開ける*2,3。 |
| 2．洗浄 |
| 固定液を除き、1x PBSを1mL加えて1分間静置する。 1x PBSを除き、新しい1x PBSを1mL加えて1分間静置する。 この作業を2回繰り返す。 |
| 3．透明化処理 |
| 1x PBSを除き、ClearSee®を1.3mL加える。 マイクロチューブのフタを開けたままパラフィンフィルムで密封し、針で通気穴を数カ所開ける。デシケーターに入れ、真空ポンプにより減圧し、室温で1時間、静置する。 パラフィンフィルムを外し、マイクロチューブのフタを閉め、遮光して室温で静置し、透明化する*4。 必要に応じて、新しいClearSee®で置換する。 |
| 4．透明化処工程 |
| ClearSee®を用いた透明化方法に必要なもの | |
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【注意点】
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ClearSee ® 観察例
5.観察
スライドガラスの上にワセリンやグリースなどで囲いを作り、ClearSee®を適量のせます。ピンセットで植物試料を移し、カバーガラスをのせて、蛍光顕微鏡下で観察する。ClearSee®は乾燥してしまうと析出するので、ワセリンやグリースなどで乾燥を防ぐ。観察後は、ClearSee®が入ったマイクロチューブに植物試料を戻すと、保存することができます。
また、ClearSee®で透明化した植物試料は、蛍光色素で染色することも可能です。細胞核を染色するときはビスベンズイミドH33258三塩酸塩、ビスベンズイミドH33342やDAPIを終濃度10μg/mL、細胞壁を染色するときは終濃度1mg/mLになるようにClearSee®の中に加えて、1時間静置後、新しいClearSee®に置換して、1時間静置後に、蛍光顕微鏡下で観察して下さい。
図1. 透明化したシロイヌナズナの葉は、明視野では透明に見え、クロロフィルの赤い自家蛍光がなくなる。
丸ごと葉が観察できるので、内部にある維管束の蛍光タンパク質も観察できる。スケールバーは200μm。
図2. ClearSee ®により透明化しためしべを丸ごと蛍光観察。 花粉管を4色の蛍光タンパク質で(青色、緑色、黄色、赤色)で 目印をつけている。 Kurihara et al. (2015)より改変して転載。 | 図3. ClearSee ®により4日間処理したシロイヌナズナの根。 オーキシン応答細胞の核を緑色、全身の細胞核を紫色で示す。 Kurihara et al. (2015)より改変して転載。 |
他の植物種
ClearSee®で6日間透明化したトレニア、ペチュニア、タバコ、トマト、キュウリ、イネの葉。
イネの場合、葉の表面にワックス層があり、組織の中に溶液を浸透させることが困難、クロロホルムなどの有機溶媒に10~30秒浸けることによりワックスを取り除いた後、固定の手順を始めて下さい。
参考文献
1． Kurihara, D. et al.: Development, 142, 4168-4179 （2015）.
製品紹介
＊製品コードをクリックするとSiyaku.comにリンクしますので、現在の価格、在庫はそちらからご確認下さい。
･･･2～10℃保存 ･･･-20℃保存 ･･･-80℃保存 表示がない場合は室温保存です。
･･･特定毒物 ･･･毒物 ･･･劇物 ･･･毒薬 ･･･劇薬 ･･･危険物 ･･･向精神薬
･･･特定麻薬向精神薬原料 ･･･化審法 第一種特定化学物質 ･･･化審法 第二種特定化学物質
･･･化学兵器禁止法 第一種指定物質 ･･･化学兵器禁止法 第二種指定物質
･･･カルタヘナ ･･･覚せい剤取締法 ･･･国民保護法
掲載されている試薬は、試験・研究の目的のみに使用されるものであり、「医薬品」、「食品」、「家庭用品」などとしては使用できません。 |