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長田 和実山崎 邦郎ボーシャン、ゲイリー、ケイ JP 2005502048 公表特許公報(A) 20050120 2003525292 20020816 体臭の加齢変化の評価法 大正製薬株式会社 000002819 モネル ケミカル センシズ センター 599150263 Ｍｏｎｅｌｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｅｎｓｅｓ Ｃｅｎｔｅｒ 浅村 皓 100066692 浅村 肇 100072040 安藤 克則 100107504 池田 幸弘 100102897 長田 和実 山崎 邦郎 ボーシャン、ゲイリー、ケイ US 60/313,013 20010820 7 G01N33/493 G01N30/88 JP G01N33/493 A G01N30/88 C AP(GH,GM,KE,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),EP(AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,LU,MC,NL,PT,SE,SK,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,BZ,CA,CH,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DZ,EC,EE,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,MN,MW,MX,MZ,NO,NZ,OM,PH,PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,UZ,VC,VN,YU,ZA,ZM,ZW JP2002008323 20020816 WO2003021260 20030313 26 20040220 2G045 2G045AA29 2G045CB03 2G045DA80 2G045FB06 【技術分野】【０００１】本発明は、Ｙ字型迷路、ＧＣによる加齢に伴い発生する匂い物質の検出法に関する。【発明の開示】【課題を解決するための手段】【０００２】実験動物及び尿の採取法Ｙ迷路用の匂いセンサーとして（ｎ＝５）、及び体臭の加齢に伴う変化を評価するための実験動物として、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｈ−２−ｋ）を用いた。マウスは若齢（１−３ｍｏｎｔｈｓ）、成体（３−１０ｍｏｎｔｈｓ）、老齢（＞１７ｍｏｎｔｈｓ）の３群（ｎ＝１５−３０）に分けた。匂い源は尿を用いた。マウスの膀胱を、なるべくストレスを与えないように軽く圧迫することにより各群より尿を集めた。それぞれの尿サンプルは同じグループの２−６匹のマウスより採取した尿の混合物である。それぞれのサンプルは−２０℃にて保存した。【０００３】Ｙ字型迷路法およびガスクロマトグラフィーサンプルの調整尿サンプルのエーテル抽出画分は（文献１）の方法に準じて作成した。マウス尿はＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（Ａｍｉｃｏｎ，１０，０００ ＭＷ ｃｕｔ ｏｆｆ）５００ｘ ｇ（６５００ｒｐｍ）５℃の条件でｍａｊｏｒ ｕｒｉｎａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎなど、尿中蛋白質を遠心濾過した。濾過済のマウス尿１．０ｍｌに対し、２００ｍｇのＫＨ2ＰＯ4で飽和させ、弱酸性（ｐＨ４．４−４．６）とし、１５倍容のｄｉｅｔｈｙｌ ｅｔｈｅｒ（ＨＰＬＣ ｇｒａｄｅ）を加え、２時間振盪抽出した。抽出液を７．５ｍｌずつ試験管に分注し、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃで０．５ｍＬまで濃縮し（６０ｍｉｎ）、約７０分間凍結乾燥を行った。【０００４】Ｙ字型迷路法Ｙ字型迷路法による体臭の評価は文献２の方法に準じて行った。Ｙ字型迷路の全体図を図１に示す。Ｙ字型迷路法では同系統であるが年齢の異なる２群のマウスの尿サンプルをＹ字型迷路の両側腕の先端にある箱にそれぞれ入れ、どちらか一方の匂いを選ぶようにマウスを訓練する。餌は十分に与えるが、水を制限されたマウスが正しい匂いを選んだときのみ、報酬として一滴の水を与える。仮に匂いの識別ができたとすれば、動物の年齢によって産出する匂いが相違する証拠となる。訓練マウスの正答率は最初の数日は５０％程度であるが、徐々に正答率が増え、８０％を超える正答率を示す。今回は成体群と老齢群の５倍希釈の尿をまず識別させ、続いて尿のエーテル抽出物の識別が可能かどうか確かめた後、最後に異なった尿のエーテル抽出物サンプルを用いて水の報酬なしで識別しうるかを測定した。【０００５】ガスクロマトグラフィーの条件ガスクロマトグラフィーはＶａｒｉａｎ３３００を用いた。分離用カラムはＳｔａｂｉｌｗａｘ ｃｏｌｕｍｎ（３０ｍ×０．３２ｍｍ ｉ．ｄ．・１０μｍ ｄｆ）を使用し、５ｍ×０．５３ｍｍ ｉ．ｄ．のガードカラム（Ｒｅｓｔｅｋ，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）を装着し実験に使用した。サンプルは上記の通り弱酸性尿のエーテル抽出物をｍｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅに再溶解させたものを用い、マウス尿中の揮発性有機酸、アミン、アミドなどを中心とした画分の同定を行った。カラム温度は８０℃で２分間保った毎に毎分５℃のペースで２４０℃まで上昇させた。キャリアーガスはヘリウムを用い、線速度は３７ｃｍ／ｓｅｃ（カラム温度４０℃時）とした。クロマトグラム上の成分の定量はピーク百分率法に基づいて行った。【０００６】結果及び考察Ｙ字型迷路による識別実験の結果、老若の尿中に含まれる体臭成分の識別トレーニングの成立した匂いセンサーマウスは５倍希釈尿の識別率が８２％（ｐ＜０．００１；施行回数６０回）であったのに対し、尿エーテル抽出物中において９１％（ｐ＜０．００１；施行回数７３回）と高い識別率を示した。また無報酬のｇｅｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ試験においても８４％（ｐ＜０．００１；施行回数２５回）と高い識別率を示した。この結果より加齢に伴い変化する体臭物質は尿エーテル抽出物中に含有されていることが証明された（図２）。【０００７】若齢群、成体群、及び老齢群の尿エーテル抽出物中のガスクロマトグラム（図３）、及びＧＣ−ＭＳにより構造決定された化合物の一覧表を示す（表１）。【０００８】尿エーテル抽出物中には多くの物質ピークが確認されたが、各年齢群のいずれかのみに特異的に見られる化合物は発見できなかった。この事実は、体臭の加齢変化は特異的な単一物質の出現によるのではない事を示している。しかしながら我々が観察した３８ピークの化合物中、若齢群及び成体群に比較して老齢群で有意に増加する化合物が５種類、減少する化合物が３種類見られた（表１）。これらのうち加齢に伴い増加するタイプの化合物が主な老臭物質であると考えられ、それらのうち構造の解っているものは、２−Ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅ（Ｎｏ．３４）、Ｉｎｄｏｌｅ（Ｎｏ．２５）、Ｐｈｅｎｏｌ（Ｎｏ．１３）、Ｃｅｄｒｅｎｅ（Ｎｏ．３）の４種類の化合物である。それに加え、ガスクロマトグラムのリテンションタイム３１分付近に現れるＮｏ．２６の未知の化合物（表１参）を含めた５種類の化合物が老齢動物に特異的に高く発生してきたものである。一方加齢に伴い低下する化合物は３種類あり、それぞれＮｏ．６（Ｍｅｔｈｙｌ Ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ），Ｎｏ．３１（ｕｎｋｎｏｗｎ），Ｎｏ．３２（ｕｎｋｎｏｗｎ）である。【０００９】２−Ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅはフェニルアラニンの代謝物の一種で、フェニル酢酸の前駆体である。フェニル酢酸はＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉ分子のハプロタイプの違いによって体液中に排泄される量が厳密に規定されている（文献１）。さらにＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉの欠損マウスを用いた研究では、ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉの細胞表面への表出が正常な匂い型の形成に必要であることが解っており（文献３）、マウス体臭の加齢変化もＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉ欠損マウスでは識別しにくいことがＹ字型迷路を用いた実験で明らかになっている（データ未発表）。これらの事実は、２−ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅが免疫機能の加齢変化を反映する老臭物質である可能性を示唆している。【００１０】Ｉｎｄｏｌｅはトリプトファンの代謝物であり、消化管内フローラにより生成されたものである可能性が高い。従って本老臭物質は腸内フローラの加齢変化あるいは消化管機能の加齢変化などを反映する可能性がある。Ｃｅｄｒｅｎｅはマウスのｂｅｄｄｉｎｇなど生活環境により体内に蓄積したものと考えられる。【００１１】これらの化合物のうち１種類あるいは２種類以上の含有量の変化を測定することにより体臭の加齢変化を評価することが可能となる。【００１２】参考文献【非特許文献１】Ｓｉｎｇｅｒ，Ａ．，Ｂｅａｕｃｈａｍｐ，Ｇ．Ｋ．＆ Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｋ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４，２２１０−２２１４【非特許文献２】Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｋ．，Ｂｅａｕｃｈａｍｐ，Ｇ．Ｋ．，Ｂａｒｄ，Ｊ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｌ．＆ Ｂｏｙｓｅ，Ｅ．Ａ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８，５８１７−５８２０【非特許文献３】Ｂａｒｄ，Ｊ．，Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｋ．，Ｃｕｒｒａｎ，Ｍ．，Ｂｏｙｓｅ，Ｅ．Ａ．＆ Ｂｅａｕｃｈａｍｐ，Ｇ．Ｋ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．５１，５１４−５１８【図面の簡単な説明】【００１３】【図１】Ｙ字型迷路の模式図である。【図２】尿及びエーテル抽出物に対する識別トレーニングの正答百分率である。【図３】Ｂ６−Ｈ２Kマウスからの３種の異なる尿サンプルのエーテル抽出物のＧＣ分析によるクロマトグラフである。 実験動物、あるいは人の体液中の加齢に伴い変化する揮発性有機物を測定することによる体臭の加齢変化の評価法。 揮発性有機物が、体液のエーテル抽出物中に見いだされる有機物である、請求項１記載の評価法。 揮発性有機物が２−Ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅ，Ｉｎｄｏｌｅ，Ｐｈｅｎｏｌ，Ｃｅｄｒｅｎｅ（加齢に伴い増加）、Ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ（加齢に伴い減少）である、請求項１記載の評価法。 請求項１及び２の体液が尿である、請求項１又は２記載の評価法。 課題：体臭の加齢変化を、１）実験動物の匂い識別能力による方法および２）機器分析学的手法あるいは３）その組み合わせにより評価する方法。解決手段：マウス尿中に存在する体臭物質である２−Ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅ，Ｉｎｄｏｌｅ，Ｐｈｅｎｏｌ他数種類の揮発性有機物が加齢に伴い増加あるいは減少する事を見いだした。これらの化合物をＹ字型迷路法、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）あるいは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）など機器分析的手法を用いて定量することにより動物の体臭の加齢変化を評価する事ができる。