Overview

図1の左に示すのは間期の培養線維芽細胞、右は分裂中のHeLa細胞である。
線維芽細胞では、phaloidinで赤く染めたアクチン線維が細胞内を縦横に走っているのが見られる。これらをストレス・ファイバーと称する。
また、右のHeLa細胞は核分裂が終わって細胞質分裂に入ったところであるが、分裂溝に収縮環と言われるアクチン線維が集積している。この収縮環が収縮することにより細胞質分裂が遂行される。ここで見られるストレス・ファイバーも収縮環もいずれもがRhoと呼ばれる低分子量G蛋白質によって形成が誘導される。

Rhoは低分子量GTP結合蛋白質の一つで、GTPを結合した活性化型とGDPを結合した不活化型の間を往復して細胞内の分子スイッチとして働いている。

我々が発見したRhoを特異的に不活化するボツリヌスC3酵素や活性化型Rhoの発現実験から、 Rhoは、上に示したストレスファイバーや細胞質分裂の他に、細胞移動、神経突起の退縮、平滑筋の収縮、細胞周期のG1-S期進行、細胞の癌化などに働くことがわかっている。

Rhoの本質的な機能は、細胞のなかで時空間特異的にアクチン細胞骨格を形成し、他の分子が働く舞台を提供することである。良く解析された例では、形成されたアクチン線維にミオシンが働き、この収縮により細胞内で張力を発生する。
図2に示すように、間期の細胞では、これはアクチンストレスファイバーの形成となって現れ、細胞外基質への結合を増強する。分裂細胞では、これは収縮環の生成と維持になって現れ、細胞質分裂を遂行する。また、平滑筋細胞では、平滑筋収縮の増強を起こす。これらの作用は、モノマーの重合によるアクチン線維の形成とミオシンがこれら線維をcross-linkすることによるアクトミオシン束の形成、さらに、ミオシンの活性化による張力の発生など幾つかの反応が統合されて発揮される。

Rho作用を上記のように考えると、問題は、Rhoがどのようにアクチン線維を紡ぎだすか、これがいかにしてアクトミオシン束に発展するか、また、ミオシン以外のどのような分子と相互作用していかなる細胞機能を遂行するか、また、この細胞骨格形成の場所と時間がどのようにして決めるか、さらに、Rhoの様々な作用がすべて細胞骨格に対する作用から説明できるか、ということになる。Rhoの作用は、Rhoが下流のエフェクターを活性化することにより遂行される。
我々は、Rhoエフェクターとして働く分子を多種類同定してきた（図3）。

このうちアクチン細胞骨格に対する作用がはっきりしているのが、Rho結合キナーゼ(ROCK)とmDiaである。
mDiaはアクチン重合を促進し繊維化アクチンの増生をおこす。What’s newに記したように、最近の研究で、mDia分子は、Arp2/3複合体と並んで、細胞内の基本的なアクチン核化・重合因子であることがわかってきた。興味深いことに、mDiaが真直ぐな長いアクチン線維を形成するのに対し、Arp2/3は、網目状のアクチン線維形成を行なう（図4）。一方、ROCKはミオシン脱リン酸化酵素やLIMキナーゼをリン酸化して、アクトミオシン収縮力の増強とアクチン脱重合の抑制に働く。
すなはち、ROCKとmDiaの作用を合わせるとアクチンモノマーからアクトミオシン束形成までの生化学過程が構成できる（図5）。

では、このような作用が発揮された結果として細胞の形態はどのようにして決まるのだろうか？
図6に、HeLaでの結果を示す。ここでは、活性化ROCKの単独発現では、アクトミオシンの強い収縮により細胞が円形化すること（左）、これに対し活性化mDiaの単独発現では、細いアクチン線維の増生とともに細胞の伸長が起こること(中)、両者の共発現では、伸長した細胞に適度のアクトミオシン束が走ること(右)が見られている。

これらの結果は、mDiaとROCKは、協調してストレスファイバーの形成に働くのみでなく、互いに拮抗する働きもあり、Rhoの下流でのこの2つのエフェクターのバランスにより最終的な表現形が決定されることを示している。詳細な解析の結果、mDiaは、c-Src を介してRacの活性化に繋がっており、この経路とROCKの経路が拮抗していることが明らかになった（図７）。

また、Rho-ROCK経路とRho-mDia-Sc-Rac経路の選択は活性化Rhoのレベルが決定していること、これが低いとmDia経路が優先的に活性化されることも明らかとなった。この経路は、神経細胞でも働いており、培養小脳顆粒細胞での実験から、アクソンが退縮するか、伸長するかも、ROCKとmDiaにより決定されることがわかった。

さらに、What’s newに記載したように、最近、Rho-mDia1-c-Src-Rac経路が、細胞移動の際、c-Srcを細胞接着斑に集積するため用いられ、この結果、接着斑のturnoverが起こることが明らかになっている。

上記のmDiaの作用とともに我々がmDiaの役割として重要と考えているのが、この分子による微小管の配向である。この例を図8に示す。
我々の考えは、mDiaは、Rhoの下流にあって、アクチン細胞骨格と微小管を統合して細胞形態、運動を制御しているというものである。我々はこの働きが、細胞の移動、神経突起の方向性、細胞分裂などで大切な働きを果たしていると考え、解析している。実際What’s newに記載したように、mDia isoformを介する微小管の配向が、移動細胞の極性形成や、細胞分裂時の染色体のcongressionなどで重要な働きを為していることが明らかになりつつある。今後は、これがmDiaのアクチンに対する作用とどのような関係があるかを明らかにすることが重要と考えている。

さて、ここまで述べたRhoの細胞内機能とそのシグナル伝達とともに、我々が大事と考えているのが、この経路が個体の発生、発達、生理、病態生理でどのように働いているかということである。

我々は、すでにROCKの特異的阻害薬としてY-27632を発見、報告した。
この化合物は、以後、世界の1,000箇所以上の研究室で使用され、Rho-ROCK経路が高血圧などの病態時の平滑筋収縮やがん細胞の転移・浸潤などで働いていることが見出されている。しかし、この経路が個体の発生にどのように働いているか、また、この経路の慢性的な阻害が個体の生理機能にどのような影響を与えるかは、不明である。また、その他のRhoシグナル経路が、一体、どのような機能を発揮しているかもわかっていない。

我々は、これらを明らかにするために、図3に示したRhoエフェクターを系統的にgene targetingしている。既に、ROCK-I, ROCK-IIの二つのisoformについては、各々の単独欠損のホモ接合体を得て、解析を実施した。例として、ROCK-Iのホモ接合体の解析を図9に示す。現在、これに引き続き、ROCK-IとROCK-IIの各々の欠損マウスの掛け合わせによる2重欠損マウスやmDiaの3つのisoformの欠損マウスを作成しており、これにより、これまで全く想定できなかったようなRhoの機能を明らかにできるものと期待している。