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橿淵 暢夫藪崎 次郎八木 寿和 JP 3618093 特許公報(B2) 20041119 2002060346 20020306 角質細胞の染色方法及び角質細胞標本の作成方法 ポーラ化成工業株式会社 000113470 遠山 勉 100089244 松倉 秀実 100090516 川口 嘉之 100100549 橿淵 暢夫 藪崎 次郎 八木 寿和 JP 2001331073 20011029 20050209 7 G01N33/50 A01N1/00 G01N1/28 G01N1/30 G01N33/48 JP G01N33/50 Q A01N1/00 G01N1/30 G01N33/48 P G01N1/28 F 7 G01N 33/50 A01N 1/00 G01N 1/28 G01N 1/30 G01N 33/48 特開昭６０−０４７９６０（ＪＰ，Ａ） 特開昭６３−３０５３１８（ＪＰ，Ａ） 特開２０００−００５１３４（ＪＰ，Ａ） 7 2003202336 20030718 9 20030318 宮澤 浩 【０００１】【発明の属する技術分野】本発明は、肌の状態の鑑別や化粧料の適切な選択に有用な情報を与える、角質細胞の染色方法及び角質細胞標本の作成方法に関する。【０００２】【従来の技術】肌の状態は、季節、体調などの変動要因や、化粧料の塗布などのお手入れなどによって時々刻々変化するものであり、変化にあわせて適切な化粧料を選択することが、老化を防止したり、肌の性状を美しく保ったりする上で重要な因子となってくる。この為、肌の性状や状態を客観的且つ科学的に鑑別する方法が考案されている。この様な方法としては、例えば、顔などの肌より角質細胞を粘着テープや粘着ディスクで採取し、これを染色し、角質細胞の配列の規則性、角質細胞の形、角質細胞の大きさ、剥がれ方、角質細胞に於ける核の有無等を指標に肌の状態などを鑑別することが例示できる。この様な鑑別に於いては、バックと細胞質とのコントラストが明確に出来、これにより個々の細胞の形状が確認できると同時に核の有無の存在も確認できる染色法が好ましいため、ゲンチアナバイオレットとブリリアントグリーンとによって染色する方法がとられている。しかしながら、この方法に於いては、染色には時間がかかるため、カウンセリングなどの場において即断するための情報源とはならず、角質細胞の形状を指標とする肌の鑑別で化粧料などを選択する場合には、肌分析から化粧料サンプルの提示まで数日を要し、タイムラグが生じてしまう欠点があった。通常、この様な場合には染色剤の濃度を上げることが検討されるが、ゲンチアナバイオレットもブリリアントグリーンも水に対する溶解限度まで濃度を上げても（ゲンチアナバイオレット１％、ブリリアントグリーン０．５％）、その染色には１０分以上かかってしまい、染色に要する時間の問題は依然残った。染色に於いては通常有機溶剤の使用は、染色特異性を損なったり、細胞の変質、変性を起こしたりするためにタブーとされており、この様な角質細胞の染色には用いられていない。従って、皮膚を粘着体でストリップして得た角質細胞を含む試料の染色法であって、前記染色工程に於ける染色剤溶液が水と混和可能な有機溶剤を含有することを特徴とする、角質細胞の染色法は全く知られていない。【０００３】更に、通常染色された角質細胞サンプルは標本全体の屈折率を同じに調整するため、封入の操作を行うが、かかる封入剤としてはバルサムや紫外線硬化樹脂が通常用いられている。しかしながら、これらの封入剤は往々にして染色剤のにじみを誘発するため、細胞の面積などを二値化によって自動計測する場合には誤差を大きくしてしまうため好ましくない。加えて、粘着テープを角質細胞の採取に用いた場合には、この様な封入に使用される有機溶剤によってテープや粘着剤が溶解してしまうこともあり使用は不可能である。前記のようにカウンターカウンセリングなどによって迅速な角質細胞の分析を行う場合には、面積の測定の二値化による自動化は避けられず、このにじみの解決は特に重要な事項であり、この解決は強く望まれていた。この様な封入に１気圧、２５℃で液体の油脂成分及び／又は油脂組成物が用いられたことはない。これは、液体の封入剤は１ヶ月以上の保存が困難であることと、この様な素材が封入剤として今まで使用されたことが皆無であったためである。従って、この様な封入剤を用いることにより、染色剤のにじみが殆どない、二値化による角質細胞面積の自動測定が可能な角質細胞標本が作成できることは全く知られていなかった。【０００４】【発明が解決しようとする課題】本発明は、短時間で角質細胞が明瞭に染色でき、カウンセリングに有用な情報を迅速につかめる、角質細胞の染色方法及び角質細胞標本の作成方法を提供することを課題とする。【０００５】【課題を解決するための手段】本発明者らは、この様な状況に鑑みて、短時間で角質細胞が明瞭に染色でき、カウンセリングに有用な情報を迅速につかめる、角質細胞の染色方法及び角質細胞標本の作成方法を求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、皮膚を粘着体でストリップして得た角質細胞を含む試料の染色方法であって、前記染色工程に於ける染色剤溶液が水と混和可能な有機溶剤を含有することを特徴とする、角質細胞の染色法で染色することにより短時間で鮮明な染色が可能となり、更に前記染色した標本を１気圧、２５℃で液体の油脂成分及び／又は油脂組成物で封入することにより、染色剤のにじみなく封入することが可能となり、従って、標本からの角質細胞について、二値化、角質細胞面積の自動測定が可能となることを見出し発明を完成させるに至った。即ち、本発明は、以下に示す技術に関するものである。（１）皮膚を粘着体でストリップして得た角質細胞を含む試料の染色方法であって、染色工程に於ける染色剤溶液が水と混和可能な有機溶剤を含有することを特徴とする、角質細胞の染色方法。（２）染色剤がゲンチアナバイオレットとブリリアントグリーンを含有するものであることを特徴とする、（１）に記載の角質細胞の染色方法。（３）水と混和可能な有機溶媒が、エタノールであることを特徴とする、（１）又は（２）に記載の角質細胞の染色方法。（４）粘着体が粘着テープであることを特徴とする、（１）〜（３）何れか１項に記載の角質細胞の染色方法。（５）皮膚を粘着体でストリップして得た角質細胞を含む試料を染色した標本の作成方法であって、染色された標本を１気圧、２５℃で液体の油脂成分及び／又は油脂組成物で封入することを特徴とする、角質細胞標本の作成方法。（６）封入に用いる１気圧２５℃で液体の油脂成分及び／又は油脂組成物がシリコーン油、脂肪酸トリグリセライド、高級アルコールと脂肪酸のエステル及び炭化水素から選択される１種乃至は２種以上であることを特徴とする、（５）に記載の角質細胞標本の作成方法。（７）角質細胞を含む試料の染色が（１）〜（４）何れか１項に記載の角質細胞の染色方法によって染色されたものであることを特徴とする、（５）又は（６）に記載の角質細胞標本の作成方法。（８）角質細胞の面積測定、有核細胞の存在の有無、有核細胞の出現頻度、角質細胞の配列の規則性、角質細胞の形、及び角質細胞の剥離状況から選択される１種乃至は２種以上の測定又は判別用であることを特徴とする（５）〜（７）何れか１項に記載の角質細胞標本の作成方法。以下、本発明について、実施の形態を中心に更に詳細に説明を加える。【０００６】【発明の実施の形態】（１）本発明の角質細胞の染色方法本発明の角質細胞の染色方法は、皮膚を粘着体でストリップして得た角質細胞を含む試料の染色方法であって、前記染色工程に於ける染色剤溶液が水と混和可能な有機溶剤を含有することを特徴とする。即ち、本発明は、水と混和可能な有機溶剤で染色剤を溶解したもので、皮膚を粘着体でストリップして得た角質細胞を含む試料を染色することを特徴とする。ここで、皮膚をストリップする粘着体としては、例えばセロハンテープなどの粘着透明テープやポリエチレンテレフタレート板に粘着剤を塗工した粘着ディスクなどが好ましく例示できる。この内、好ましいものは市販品が存在し、入手が極めて容易である、粘着テープである。かかる粘着体で肌をストリップして得た試料はそのまま染色させることもできるし、再度粘着体に接触させて転写させて使用することもできる。好ましい方法はそのまま使用する方法であり、これは手間が減らせるからである。本発明の染色法によれば、粘着剤やテープやディスクなどの粘着体の支持体部分にも影響を与えることがないため、採取した形態でそのまま染色することができる。本発明の染色法では通常使用されている染色剤であれば特段の限定なく使用でき、例えば、エオシン、ヘマトキシリン、ゲンチアナバイオレット、ブリリアントグリーン、マラカイトグリーンなどが好ましく例示でき、これらは唯一種でも二種以上を組み合わせても使用できる。これらの内ではゲンチアナバイオレットとブリリアントグリーンを組み合わせて用いるのが特に好ましい。これは、ゲンチアナバイオレットによってバックグランドに対してコントラスト良く細胞質を染色できるため、角質細胞の形状を明確にすることが可能であり、かかる細胞質をバックグランドとして、ブリリアントグリーンによって明瞭に核が染色できるからである。かかる染色剤を水と可溶な有機溶剤を含む液体媒体に溶解させ染色することが本発明の染色法の特徴である。染色剤の好ましい含有量は、２〜７重量％であり、ゲンチアナバイオレットとブリリアントグリーンの組み合わせであれば、ゲンチアナバイオレットが１．５〜５重量％であり、更に好ましくは２〜４重量％であり、ブリリアントグリーンが０．７〜２重量％であり、更に好ましくは０．８〜１．５重量％である。又、水と可溶な有機溶剤としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、１，３−ブタンジオール等のアルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、アセトニトリルなどのニトリル類、テトラヒドロフランの様なエーテル類などが好ましく例示できる。これらの中ではアルコール類が好ましく、中でもエタノールが特に好ましい。かかる水に可溶な有機溶剤の液体媒体に於ける好ましい含有量は、３〜５５重量％であり、更に好ましくは５〜５０重量％である。これは有機溶剤が多すぎても時間は短縮しないし、却って粘着剤や粘着体の支持体を損なう場合があり、少なすぎると染色鮮明化効果が得られない場合があるからである。この様な本発明の条件下に於いては、染色に要する時間は１〜５分程度であり、従来の方法（ゲンチアナバイオレット０．５〜１重量％とブリリアントグリーン０．２〜０．５重量％）の１０〜３０分に比して格段の時間短縮を見ている上に、コントラストの明瞭化も著しい。又、この様な染色は室温でも行うことができる。【０００７】（２）本発明の角質細胞標本の作成方法本発明の角質細胞標本の作成方法は、皮膚を粘着体でストリップして得た角質細胞を含む試料の染色した標本の作成方法であって、前記染色した標本を１気圧、２５℃で液体の油脂成分及び／又は油脂組成物で封入することを含むことを特徴とする。ここで、皮膚を粘着体でストリップして得た角質細胞を含む試料の染色したサンプルとしては、通常この様な工程で作成されているものであれば何れも適用可能であるが、特に好ましいものは、前記（１）の本発明の角質細胞の染色方法によって染色されたサンプルである。本発明の角質細胞標本作成法で使用する、１気圧、２５℃で液体の油脂成分及び／又は油脂組成物としては、通常化粧料や医薬で使用される油脂分或いはそれらを組み合わせた組成物であって、１気圧２５℃で液状のものであれば特段の限定なく使用することができる。この様なものの好ましい組み合わせとしては、１気圧、２５℃で液体の、シリコーン油、脂肪酸トリグリセライド、高級アルコールと脂肪酸のエステル及び炭化水素から選択される１種乃至は２種以上が好ましく例示できる。通常液体成分による封入は通常１ヶ月以上の安定性が得られないが、本発明の目的とする、カウンターでのカウンセリングのような即時的な使用では何ら問題がない。前記油剤に於いては染色剤のにじみは認められず、得られた標本の顕微鏡像を画像として取り込み、染色しているかいないかの２つの値に分けて（二値化処理）角質細胞の形状を正確に浮かび上がらせることが出来、これによって角質細胞面積を正確に自動計測することができる。これ以外に本発明の標本作成法によって製造された標本から得られる情報としては、有核細胞の存在の有無、有核細胞の出現頻度及び角質細胞の剥離状況、角質細胞の配列の規則性、角質細胞の形等が挙げられ、本発明の標本はこれらの数値の測定又は判別に用いられることが好ましい。即ち、本発明の方法によって作成された角質細胞標本は、角質細胞の面積測定、有核細胞の存在の有無、有核細胞の出現頻度、角質細胞の配列の規則性、角質細胞の形、及び角質細胞の剥離状況から選択される１種乃至は２種以上の測定又は判別用に用いられることが好ましい。【０００８】【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明がこれら実施例にのみ限定されないことは言うまでもない。【０００９】＜実施例１＞同一パネラーより角質細胞を粘着テープストリッピングにより３種採取し、２種は本発明の染色法によって染色した。即ち、ゲンチアナバイオレット３重量％とブリリアントグリーン１重量％を２０％エタノール水溶液に溶解させた染色液に２分間浸漬し、充分に水洗した。１方は紫外線硬化樹脂に封入し、紫外線を照射し硬化させた（比較例１）。もう１方は本発明の角質細胞標本の作成方法に従って、ジメチコン（シリコーン）に封入した（実施例１）。のこる１つはゲンチアナバイオレット１重量％とブリリアントグリーン０．５重量％を水に溶かした染色液に１０分間浸漬し、充分に水洗した後ジメチコンに封入した（比較例２）。これらの標本の顕微鏡写真を図１〜３に示す。図１〜３に示すように、比較例１ではにじみが生じることでコントラストが小さくなり、比較例２では角質細胞の染色が薄くなってしまうのに対し、実施例１ではにじみがなく（比較例１に比べてコントラストが大きく）且つ良好な染色状態が得られた。これより、本発明の方法によって作られた角質細胞標本の作成法は角質細胞が鮮明且つ明瞭に識別できることが判る。【００１０】＜実施例２＞実施例１で作られた実施例１、比較例１、比較例２の標本を用いて角質細胞の平均面積を算出した。又、実施例１についてはマニュアルで二値化して平均面積（単位：μｍ２）を算出した。平均を算出するのに用いた細胞数は２０個であった。結果を表１に示す。これより、本発明によれば自動面積算出を行ってもマニュアルと同じ結果が得られていることがわかる。又、細胞の不明確な標本やにじみのある標本では自動面積算出では実際の面積より大きい値が出ていることが判る。【００１１】【表１】【００１２】＜実施例３＞実施例１の測定法に準じて、ゲンチアナバイオレットの濃度を変えて検討を行った。ブリリアントグリーンは１重量％のままであった。封入はジメチコンを用いた。染色の鮮明さを「○：鮮明に染色されている」、「△：やや不明瞭」、「×：不明瞭」の判定基準で評価した。結果を表２に示す。これよりゲンチアナバイオレットの好ましい含有量は、１．５〜５重量％が好ましく、２〜４重量％が更に好ましいことが判る。【００１３】【表２】【００１４】＜実施例３＞実施例３と同様にブリリアントグリーンの濃度を変えて同様の検討を行った。サンプルとしては有核細胞の観察される皮膚状態の悪い人の角質細胞標本を用いた。核の染色具合の鮮明度を実施例３と同じ基準で判定した。結果を表３に示す。これよりブリリアントグリーンの好ましい濃度は０．７〜２重量％であり、更に好ましくは０．８〜１．５重量％であることが判る。【００１５】【表３】【００１６】＜実施例４＞実施例１と同様の手法でエタノールの濃度を変えて検討を行った。同時に染色剤の沈殿（不溶部分）の有無も確認した。染色の明瞭さは「○：鮮明に染色されている」、「△：やや不明瞭」、「×：不明瞭」の判定基準で評価した。また、沈殿の有無は「ある」、「わずかながらある」、「ない」で判定した。結果を表４に示す。これより水に可溶な有機溶剤の液体媒体に於ける好ましい含有量は、３〜４０重量％であり、更に好ましくは５〜３０重量％であることがわかる。【００１７】【表４】【００１８】＜実施例５＞実施例１と同様に有機溶媒を２０％メタノール溶液に変えて検討を行ったが実施例１と同様に鮮明な染色の標本が得られた。【００１９】＜実施例６＞実施例１と同様に有機溶媒を１０％アセトニトリル溶液に変えて検討を行ったが実施例１と同様に鮮明な染色の標本が得られた。【００２０】＜実施例７＞実施例１と同様の手法で封入剤のみを変えて検討を行った。できあがったサンプルのにじみの無さを、「○：全くにじみがない」、「△：少しにじむ」、「×：明瞭ににじむ」の基準で判定した。結果を表５に示す。これより本発明の各層標本作製には封入剤として１気圧、２５℃で液体の油脂成分及び／又は油脂組成物を用いることが好適であることが判る。【００２１】【表５】【００２２】【発明の効果】本発明によれば、短時間で角質細胞が明瞭に染色でき、カウンセリングに有用な情報を迅速につかめる、角質細胞の染色方法及び角質細胞標本の作成方法を提供することができる。【図面の簡単な説明】【図１】実施例１の比較例１の本発明の作成方法による角質細胞標本の顕微鏡写真である。（図面代用写真）【図２】実施例１の本発明の作成方法による角質細胞標本の顕微鏡写真である。（図面代用写真）【図３】実施例１の比較例２の作成方法による角質細胞標本の顕微鏡写真である。（図面代用写真） 皮膚を粘着体でストリップして得た角質細胞を含む試料の染色方法であって、染色工程に於ける染色剤溶液が水と混和可能な有機溶剤を３〜５５重量％含有することを特徴とする、角質細胞の染色方法。 染色剤がゲンチアナバイオレットとブリリアントグリーンを含有するものであることを特徴とする、請求項１に記載の角質細胞の染色方法。 水と混和可能な有機溶剤が、エタノールであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の角質細胞の染色方法。 粘着体が粘着テープであることを特徴とする、請求項１〜３何れか１項に記載の角質細胞の染色方法。 角質細胞を含む試料を染色した標本の作成方法であって、請求項１〜４の何れか１項に記載の角質細胞の染色法によって染色された標本を１気圧、２５℃で液体の油脂成分及び／又は油脂組成物で封入することを特徴とする、角質細胞標本の作成方法。 封入に用いる１気圧２５℃で液体の油脂成分及び／又は油脂組成物がシリコーン油、脂肪酸トリグリセライド、高級アルコールと脂肪酸のエステル及び炭化水素から選択される１種乃至は２種以上であることを特徴とする、請求項５に記載の角質細胞標本の作成方法。 角質細胞の面積測定、有核細胞の存在の有無、有核細胞の出現頻度、角質細胞の配列の規則性、角質細胞の形、及び角質細胞の剥離状況から選択される１種乃至は２種以上の測定又は判別用であることを特徴とする請求項５又は６に記載の角質細胞標本の作成方法。